Florence est la fille d’un restaurateur et d’une danseuse. Son frère, Toby Sebastian, est connu pour son rôle de Trystane Martell dans la série Game of Thrones.
Enfant, elle souffre de trachéomalacie, ce qui oblige ses parents à déménager en Espagne où le climat est plus chaud. Elle retourne en Angleterre, son pays natal, à ses 6 ans alors qu’elle exprime sa volonté d’être comédienne.
En 2014, alors toujours étudiante, elle joue dans le film dramatique The Falling qui lui vaut critiques positives et sélections en festivals.
Malgré des études d’actrice, elle dit que ses écoles ne l’ont jamais encouragée ni accompagnée dans ses projets.
En 2018, elle joue dans le film d’action The Passenger puis dans le téléfilm King Lear aux côté d’Anthony Hopkins et d’Emma Thompson. Remarquée par Netflix, elle signe un contrat pour jouer dans Les Mauvais esprits et Outlaw King : Le Roi hors-la-loi.
En 2019, le magazine Forbes nomme Pugh l’une des 30 personnalités de moins de 30 ans les plus influentes d’Europe.
Elle devient célèbre grâce au film Midsommar (2019) pour lequel elle est encensée par la critique. Certains jugent qu’elle a été injustement oubliée des Oscars cette année.
Elle joue ensuite dans le film Les Filles du docteur March de Greta Gerwig. Occupée par le tournage de Midsommar, elle arrive sur le plateau deux semaines après les autres acteurs et révèle qu’elle a ainsi pu garder une certaine distance avec les autres acteurs.
En 2021, Pugh rejoint l’univers cinématographique Marvel en signant le rôle de Yelena Belova, la sœur de la super-héroïne Natasha Romanoff dans le film Black Widow. Elle sera de retour dans la série télévisée Hawkeye sur Disney+.